Characterization and detection by In situ gene amplification of marine denitrifying bacteria

Abstract

Recent studies suggest that the oceanic nitrogen budget is unbalanced, primarily due to a high nitrogen removal in contrast to the fixation rate. This imbalance likely results from denitrification activity in continental shelf sediments. Denitrifying bacteria play a major role in marine sediment nitrogen balance. In order to assess the nitrogen balance characteristic, this study utilized slow-growth enrichment microcosms. These consisted of Puget Sound, WA seawater and sediment samples enriched with dimethyl sulfoxide (DMSO) as carbon source, and nitrate in order to stimulate denitrifying activity. Two sets of microcosms were prepared and incubated in the dark for 6 months at 25oC and 4oC. Of 82 strains isolated, 18 were positive for both nitrate reduction and gas production. Amplified ribosomal DNA restriction analysis (ARDRA) was performed to compare and establish similarities between the Puget Sound isolates and control cultures. The novel in situ reverse transcription PCR (RT-PCR) method has been optimized to study the expression of the nirS gene in denitrifying bacteria. Pure cultures of reference denitrifying isolates from marine sediments were used to optimize the in situ RT-PCR protocol. We performed cell fixation after visible gas production was observed. In situ RT-PCR was performed after cell fixation and enzymatic permeabilization. The nirS 1F and nirS 6R primers were used for the amplification of cDNA and subsequently fluorescent in situ hybridization (FISH) was done to increase the detection specificity of the amplification product. Only active denitrifying cells were detected by this approach using fluorescence microscopy.

Estudios recientes, sugieren que el presupuesto oceánico de nitrógeno no esta balanceado; debido a una alta remoción de nitrógeno en comparación con la tasa de fijación. Este imbalance puede ser el resultado de la denitrificación en sedimentos de los márgenes continentales. Las bacterias denitrificadoras juegan un papel importante en el balance de nitrógeno en sedimentos marinos. Para poder determinar las características del balance de nitrógeno, este estudio utilize microcosmos enriquecidos de crecimiento lento. Éstos, consistían de agua de mar de Puget Sound, WA y muestras de sedimento enriquecidos con sulfóxido de dimetilo (DMSO por sus siglas en inglés) como fuente de carbono, y nitrato para estimular la actividad de denitrificación. Se prepararon dos grupos de microcosmos y se incubaron en la oscuridad por 6 meses a 25°C y 4°C. De 82 cepas aisladas, 18 fueron positivas para la reducción de nitrato y producción de gas. Se realizó un análisis de restricción de la amplificación del ADN ribosomal (ARDRA por sus siglas en inglés) para comparar y establecer similitudes entre los cultivos aislados de Puget Sound y las cepas usadas como referencia. El novedoso método de PCR y retrotranscripción in situ (in situ RT-PCR por sus siglas en inglés) se optimizó para estudiar la expresión del gen nirS en bacterias denitrificadoras. Cultivos puros de bacterias denitrificadoras aisladas de sedimentos marinos se usaron para optimizar el protocolo de RT-PCR in situ. Fijamos las células después de observar producción de gas. Se realizó RT-PCR in situ luego de fijar y permeabilizar enzimáticamente las células. Los primers NIRS 1F y NIRS 6R se usaron para la amplificación del cDNA y luego se realizó hibridización fluorescente in situ (FISH por sus siglas en inglés) para aumentar la especificidad en la detección del producto de amplificación. Sólo, las células denitrificadoras activas fueron detectadas por este método utilizando microscopía de fluorescencia.