Converting toxic cyanide into valuable aminoacids: isolation of β-Cyanoalanine synthase in Cassava (Manihot esculenta Crantz) and evaluation of its physiological role

Abstract

Cassava is a perennial shrub cultivated in the tropical and sub-tropical regions of the world and is characterized by its ability to develop secondary roots of high starch storing capacity. This root crop shows certain advantages such as the capability of growing in marginal conditions of drought periods and poor and acidic soils. It also shows resistance to certain herbivore pests and can persist in the soil for 8-24 months without decaying. Certain African regions contribute to the main inputs in global cassava production, where it is mainly used as a food source. Cassava is known to accumulate linamarin in all of its tissues. The enzymatic action of linamarase and HNL cause cyanide release from linamarin mainly after tissue injury, serving as chemical defense molecule against herbivores. In addition, it has been considered the implication of cyanoglycosides as storing and transportable forms of reduced nitrogen. β-cyanoalanine synthase (βCAS) provides the first step in the cyanide detoxification pathway, allowing its incorporation into the amino acid biosyntheses pathways. This enzyme belongs to the β-substituted alanine synthases (Bsas) family of enzymes, being close-related to cysteine synthase (CS). Despite the importance of the β-CAS detoxification pathway in cyanide metabolism in cassava, the enzymes involved in it have not been identified at the molecular level. This project aims to isolate the cassava Bsas genes and determine their role in cyanide metabolism. Three cDNAs were isolated using RACE-PCR, which were first identified as Bsas-specific genes harboring sequences of different molecular weight. Sequencing information led to the conclusion that two of these contained identical sequences, each one of which encodes a short and a long version of the same cDNA. Sequence analysis tools allowed the prediction of the amino acid sequences encoded by these genes, being MANes;BsasA the protein encoded by the two identical sequences and MANes;BsasB the remaining gene. Sequence cluster analyses grouped both proteins among the Bsas enzymes targeted to the mitochondria, the cell compartment where β-CAS is found. However, one of the sub-cellular location estimating tools identified MANes;BsasA as a possible plastidic enzyme, which together with the cytoplasm, comprise the two main organelles for cysteine biosynthesis. Cloning and over-expression of these genes in a bacterium of Bsas mutant background provided concrete evidence of the in vitro kinetic properties of these genes. MANes;BsasB showed higher βCAS activity levels than MANes;BsasA and ARAth;Bsas3;1, which was used as a β-CAS positive control. In the other hand, MANes;BsasA showed remarkably higher CS activity levels than ARAth;Bsas3;1, but more importantly than MANes;BsasB. This information clarifies that MANes;BsasA truly encodes a CS isoform, whose shorter version lacking the signal peptide might encode the cytoplasmic isoform. The longer cDNA could encode an enzyme of plastidic or mitochondrial sub-cellular location, since both compartments have been shown to have both enzymes. In the other hand MANes;BsasB encodes a mitochondrial β-CAS enzyme, since no other evidence has been shown that a true β-CAS protein is targeted outside this compartment. An attempt of transformation was done by cloning these genes in a plant binary vector for transformation of cassava somatic embryos. A total of 2,806 and 2,513 explants were transformed harboring the ARAth;Bsas3;1 and MANes;BsasA genes, respectively, producing a total of 80 and 212 lines that endured antibiotic selection. However, no line showed a repetitive pattern of PCR amplification, when screening these lines using different primer combinations. Moreover, no line showed increased β-CAS activity. Apparently the selection protocol employed did not guaranteed a proper selection of transgenic lines with the T-DNA integrated into its genome.

La yuca es un arbusto perenne cultivado en regiones tropicales y tiene la capacidad para desarrollar raíces secundarias con alta capacidad de almacenar almidón. Este cultivo muestra ciertas ventajas como la capacidad de crecer en condiciones marginales (sequía y suelos pobres y ácidos). También muestra resistencia a ciertas plagas de herbívoros, mientras que es capaz de persistir en el suelo por un período de 8-24 meses sin que decaiga su calidad. Ciertas regiones africanas contribuyen a los principales insumos en la producción mundial de yuca, donde se utiliza principalmente como fuente de alimento. La yuca acumula linamarina en todos sus tejidos. La acción enzimática de linamarasa y HNL causan la liberación de cianuro a partir de linamarina, sobre todo después de la lesión tisular, actuando así como molécula de defensa química contra los herbívoros. Además, también se ha considerado la implicación de los cianoglicósidos como formas de almacenamiento y transporte de nitrógeno reducido. La enzima sintetasa de β-cyanoalanina (β-CAS) provee la catálisis del primer paso en la ruta de desintoxicación del cianuro, lo que permite su incorporación a las vías de síntesis de ciertos amino ácidos. Esta enzima pertenece a la familia de sintetasas de alaninas β-sustituidas (Bsas) en la cual también se encuentra cisteína sintasa (CS), una enzima a la cual β-CAS está próximamente relacionada. A pesar de la importancia de estas enzimas en el metabolismo de cianuro en yuca, las mismas no se han identificado a nivel molecular. El presente proyecto tiene por objeto aislar los genes que codifican enzimas de la familia Bsas en yuca y determinar el rol que juega cada una en el metabolismo de cianuro. Se lograron aislar tres cDNAs utilizando RACE-PCR, dos de estos conteniendo secuencias idénticas (MANes;BsasA) y otro gen con algunas diferencias en la secuencia de nucleótidos. Análisis de cluster utilizando estas secuencias agruparon a ambas proteínas entre las enzimas Bsas específicas del mitocondrio. Sin embargo, uno de los programas utilizados para la estimación de la localización sub-celular demostró que MANes;BsasA podría ser posiblemente una enzima localizada en los cloroplastos. La sobre-expresión de estos genes en una bacteria mutante, negativa en la expresión de genes de la familia Bsas, proveyó evidencia cinética de estas proteínas. MANes;BsasB mostró mayores niveles de actividad β-CAS al comparar con los niveles mostrados por MANes;BsasA y ARAth;Bsas3;1, el cual fue utilizado como un control positivo para β-CAS. Por otra parte, MANes;BsasA mostró un nivel de catalización de la reacción de CS notablemente superior a ARAth,Bsas3,1, pero una diferencia más drástica fue observada al comparar este valor con el que obtuvo MANes;BsasB. Esta información aclara que MANes;BsasA realmente codifica una isoforma de CS, cuya versión más corta carece del péptido señal, codificando la isoforma citoplasmática. Por otra parte, MANes;BsasB codifia la enzima β-CAS Se hizo un intento transformación de embriones somáticos de yuca con éstos genes. Un total de 2,806 y 2,513 explantes se transformaron con constructos genéticos albergando los genes ARAth;Bsas3;1 y MANes;BsasA, respectivamente. Estos explantes produjeron un total de 80 y 212 líneas respectivamente, que soportaron selección con antibiótico. Sin embargo, ninguna línea mostró un patrón repetitivo de amplificación de PCR al amplificar utilizando diferentes combinaciones de cebadores específicos para cada constructo. Además, ninguna línea mostró aumento de la actividad enzimática de β-CAS en sus tejidos. Al parecer, el protocolo de selección empleados no garantizó una adecuada selección de las líneas transgénicas conteniendo el T-DNA integrado en su genoma.