Monitoring the diversity and species distribution of enterococci at a subtropical seawater system in Mayagüez, Puerto Rico

Abstract

Enterococci are an important group of bacteria used as fecal indicator by the United States Environmental Protection Agency (USEPA) to evaluate the quality of recreational waters. Specifically, a beach is “contaminated” when the enterococci concentrations exceed the guideline of 104 CFU/100ml in a single sample analysis. Unfortunately, this method only provides numerical information and it lacks the differentiation of species and contamination sources. Given the establishment of this guideline in non-tropical regions and, due the frequent exceedance in tropical environments, we hypothesize that the USEPA enterococci guideline is not a reliable method to monitor the quality of recreational waters in Puerto Rico. In order to confirm this, first, we developed a new enterococci species identification method capable of discriminating adequately among environmental isolates using the RFLP technique of the atpA 1,102-bp fragment amplification. Then, this method was combined with a biochemical screening to confirm the isolates as Enterococcus and monitor the community in a beach water system every 4 hours for 24 hours. Even though our newly developed method has a limitation identifying E. casseliflavus isolates, we were able to identify non-pigmented enterococci species. It should be noted that three enterococci species were consistently identified: E. faecalis, E. faecium and E. gallinarum. Interestingly, our findings in the 24-hour study showed that the diversity of enterococci in the beach water system was principally limited to E. faecalis, E. faecium, E. gallinarum, E. casseliflavus and other unknown species. These enterococci species were also identified during the “recent fecal contamination event” (before, during, and after), including the presence of five virulence factors (gelE, asa1, hyl, esp, and cylA) to compare the genetic makeup of the same enterococci species that were identified through the event. However, the presence of five virulence genes, limited to E. faecalis and E. faecium, had no significant variation when the enterococci concentrations exceeded, or not, the USEPA standard. Our results showed that the enterococci community was extremely dynamic, acquiring and losing species diversity before, during, and after an exceedance event. If we consider our overall results, we might suggest that those exceedance events are not necessarily by a recent fecal contamination event. Finally, although further studies are needed to determine the source of enterococci introduction, fecal or not, we have to conclude that a single numerical datum is not a reliable method to identify the potential of health risks by fecal contamination in a tropical recreational water system.

Los enterococos son un importante grupo de bacterias usados por la Agencia de Proteccion Ambiental de Estados Unidos (USEPA) como indicadores de contaminación fecal para evaluar la calidad de aguas recreacionales. Especifícamente, una playa está contaminada cuando las concentraciones de enterococos exceden el limite de 104UFC/100mL en un solo análisis. Desafortunadamente, este método sólo provee información númerica y carece de diferenciación de especies o fuentes de contaminación. Dado a que el establecimiento de este parámetro fue en regions no tropicales y, debido al frecuente incumplimiento en ambientes tropicales, hipotetizamos que el parámetro de enterocococos de USEPA no es un método confiable para monitorear la calidad de aguas recreacionales en Puerto Rico. Con la intención de confirmar esto, primero, desarrollamos un nuevo método de identificación de especies de enterococos capaz de discriminar adecuadamente entre los aislados ambientales usando la técnica de RFLP con el fragmento de amplificación de 1,102-bp del gen atpA. Luego, este método fue combinado con un filtro de pruebas bioquímicas para confirmar los aislados como Enterococcus y monitorear la comunidad en un sistema de agua de playa cada 4 horas por 24 horas. A pesar de que nuestro nuevo método desarrollado tiene limitaciones en identificar a E. casseliflavus, éste es capaz de identificar especies no pigmentadas. Cabe señalar que tres especies de enterococos fueron identificadas consistentemente: E. faecalis, E. faecium and E. gallinarum. Interesantemente, nuestros resultados en el estudio de 24 horas mostraron que la diversidad de enterococos en el sistema de agua de playa está principalmente limitada a E. faecalis, E. faecium, E. gallinarum, E. casseliflavus y otras especies desconocidas. Estas especies de enterococos fueron también identificadas durante “el evento de contaminación fecal reciente” (antes, durante y después), incluyendo la presencia de cinco factores de virulencia (gelE, asa1, hyl, esp, and cylA) para comparar el marco genético de las mismas especies que fueron identificadas a través del evento. Sin embargo, la presencia de los cinco genes de virulencia, limitados a E. faecalis y E. faecium, no tuvieron una variación significativa cuando las concentraciones de enterococos excedían, o no, el estándar de USEPA. Nuestros resultados mostraron que la comunidad de enterococos es extremadamente dinámica adquiriendo y perdiendo especies antes, durante y después de un evento de excedencia. Si consideramos nuestros resultados generales, podríamos sugerir que esos eventos de excedencia no son necesariamente debidos a un evento de contaminación fecal. Finalmente, aunque se necesitan estudios adicionales para determinar la fuente de introducción, fecal o no, tenemos que concluir que el uso de un dato númerico solamente no es un método confiable para identificar el potencial de riesgos a la salud por contaminación fecal en un sistema tropical de aguas recreacionales.