Antibiotic resistance screening in metagenomics libraries generated from cave soil of Puerto Rico

Abstract

After more than 70 years of their discovery, abuse and misuse of antibiotic substances, has selected for pathogens the abilities to confer antibiotic resistances, threatening modern medicine and becoming one of the main health concerns of the 21st century. The development of novel technology to help solve and understand the current trends in antibiotic resistance is a must. By the use of techniques such as metagenomics, the detection and analysis of functional microbial activity in the environment has been made possible through culture independent approaches. In our research a metagenomic library (ML) from cave Ventana’s soil in Puerto Rico was generated using the direct DNA extraction method. The cave environment was selected due to the low amount of studies on antibiotic resistance in caves. The ML was produced using the fosmid vectors delivered into Escherichia coli Epi300, averaging 40,000 clones. The ML was screened for resistance for some of the first and most broadly used antibiotics. After determining Minimal Inhibitory Concentration for the antibiotics; gentamicin (MIC 8. 0µg/ml), kanamycin (MIC 12.0µg/ml) and tetracycline (MIC 1.0µg/ml), the ML was spread on LB plates containing different antibiotic concentrations. Activity was found for kanamycin and tetracycline. In addition, the presence of fosmid insert in clones was confirmed through an enzyme restriction analysis. The ML showed one clone resistant to tetracycline (MIC 10.0µg/ml) and one clone highly resistant to kanamycin (MIC>1200.0µg/ml). Target genes were inactivated using Tn5 transposon mutagenesis, sequenced and bioinformatics analysis predicted an efflux like mechanism conferring the resistance for tetracycline. More data is needed to determine resistance mechanisms to kanamycin, literature suggests it could be related to aminoglycoside modifying enzymes. This is the first metagenomic library generated from caves in Puerto Rico and the first antibiotic resistance functional study done from caves in the island.

Luego de más de 70 años del descubrimiento de los antibióticos, el abuso y mal uso ha seleccionado para que la resistencia a antibióticos emerja entre patógenos microbianos. Esto amenaza la medicina moderna y se ha convertido en uno de los problemas de salud pública en el siglo 21. El desarrollo de tecnologías noveles para resolver y entender la resistencia a antibióticos es crucial. Con el uso de técnicas independientes de cultivo como la metagenómica, la detección y análisis de actividades funcional de genes de resistencia a antibióticos de comunidades microbiana en el ambiente es posible. Se produjo una biblioteca metagenómica (BM) de cueva Ventana en Puerto Rico, la misma fue generada usando el método directo de extracción. El ambiente de la cueva fue escogido debido a la poca cantidad de estudios no cultivables que existen de resistencia a antibióticos en cueva. La BM se produjo utilizando fósmidos como vectores y Escherichia coli Epi300 como huésped, resultando en un aproximado de 40,000 clones. Luego de determinar la concentración mínima de inhibición para los antibióticos gentamicina (MIC 8. 0µg/ml), kanamicina (MIC 12.0µg/ml) y tetraciclina (MIC 1.0µg/ml) la BM se esparció en platos con LB con diferentes concentraciones de antibiótico. Se estudió la biblioteca para algunos de los primeros antibióticos que más han sido utilizados a nivel mundial. Se encontró actividad para kanamicina y tetraciclina. En adición, la presencia de fósmidos se confirmó mediante un análisis de restricción. La BM mostro un clon con resistencia a tetraciclina (MIC 10.0µg/ml) y un clon altamente resistente a kanamicina (MIC>1200.0µg/ml). Los genes fueron inactivados mediante mutagenización con el transposón Tn5, secuenciados y un análisis bioinformático predijo que un mecanismo de excreción “efflux” causa la resistencia para tetraciclina. Para kanamicina se necesita más data para poder determinar el mecanismo causando la resistencia, la literatura sugiere que el mismo puede estar relacionado a encimas modificadoras de aminoglucósidos. Este es el primer estudio donde se genera una biblioteca metagenómica de cuevas en Puerto Rico y el primer estudio de resistencia a antibiótico funcional hecho en cuevas en la isla.