Pastrana-Ríos, BelindaDel Valle Sosa, Liliana2024-11-072024-11-072006https://hdl.handle.net/20.500.11801/3818Chlamydomonas centrin is an acidic, low molecular weight protein that belongs to the EF-hand superfamily of calcium binding proteins. It is an essential component of the centrosomal structure in a wide range of organisms. ¹³C-labeled Chlamydomonas centrin (¹³C-Cen) and a model peptide from bee venom, known as melittin (MLT) were studied upon complex formation. The main objective of this thesis was to study the level of protein/peptide interaction, to explore structural changes and the relative stability of centrin, mellitin, and the complex. Two sets of experiments were performed H→D exchange via attenuated total reflectance (ATR) and thermal dependence via transmission Fourier transform-infrared (FT-IR) spectroscopy. The spectral analysis was carried-out by two-dimensional correlation analysis (2D-COS). In addition, differential scanning calorimetry (DSC) experiments were performed to corroborate the existence of pre-transitions and the thermal denaturation temperature for these proteins and the complex. For the FT-IR studies, the two protein components were studied simultaneously as: the amide I’ band (1650 cm⁻¹) for MLT and the amide I*’ band (1600 cm⁻¹) for ¹³C-Cen in order to establish the structural changes during the interaction. Furthermore, the amide II band (1550 cm⁻¹) comprised of side chains and the N-H deformation mode, and the amide II’ (1450 cm⁻¹) band comprised of the N-D deformation mode for both proteins are studied to determine side chain interaction and the extent of solvation (80% for ¹³C-Cen, 100% for MLT and 100% ¹³C-Cen/MLT). The interaction within the protein complex, was driven by MLT, which was suggested from the effects observed in the α-helical motifs of centrin to a greater extent than its interaction with calcium. This effect was observed for the calorimetric studies whereby centrin pre-transition was shifted by 13 °C from 81 °C to 95 °C. Finally, these results provide the framework to study other centrin target peptides to further understand the biophysical and biochemical changes driving their interaction.Chlamydomonas centrina es una proteína ácida, de bajo peso molecular que pertenece a la superfamilia de proteínas de manos EF que enlazan calcio. Esta es un componente esencial de la estructura centrosomal de un amplio rango de organismos. La centrina de Chlamydomonas marcada con carbono 13 (¹³C-Cen) y un péptido modelo del veneno de la abeja, conocido como meletina (MLT), fueron estudiados en la formación del complejo. El principal objetivo de esta tesis fue el estudio del nivel de interacción proteína/péptido, para examinar los cambios estructurales y la estabilidad relativa de centrina, meletina y la del complejo. Se realizaron dos tipos de experimentos: se estudió el intercambio H→D a través de la reflactancia atenuada total (ATR) y luego, se analizó la dependencia termal utilizando la espectroscopía de transmisión de infrarrojo con transformada de Fourier (FT-IR) en la cuales los espectros se analizaron mediante el estudio de correlación en dos dimensiones (2D-COS). Además, se realizaron experimentos de calorimetría diferencial de barrido (DSC) para corroborar la existencia de pre-transiciones y la temperatura de desnaturalización termal de estas proteínas y el complejo. Para los estudios de FT-IR, los dos componentes proteícos fueron analizados simultáneamente como: la banda amida I’ (1650 cm⁻¹) para MLT y la banda amida I*’ (1600 cm⁻¹) para ¹³C-Cen para los cambios estructurales durante la interacción. También, se analizaron la banda amida II (1450 cm⁻¹) comprendida por el modo de deformación N-H (1550 cm⁻¹) y las cadenas laterales y la banda amida II’ comprendida por el modo de deformación N-D (1550 cm⁻¹) para determinar la interacción de las cadenas laterales y el grado de solvatación (80% para ¹³C-Cen, 100% para MLT y 100% ¹³C-Cen/MLT). La interacción entre el complejo de proteínas, esta dominada por MLT, lo que es sugerido por los efectos observados en los motivos α-hélices de centrina a un mayor grado que su interacción con calcio. Este efecto se observó en los estudios de calorimetría en donde la pre-transición de centrina se desplazó en 13 °C, de 81 °C a 95 °C. Finalmente, estos resultados que apoyan para el estudio de otros péptido blancos de centrina para poder entender los cambios biofísicos y bioquímicos que conducen a su interacción.EnglishThesisAll rights reserved(c) 2006 Liliana del Valle Sosa