Ríos Velázquez, CarlosCardona-Correa, Albin A.2024-11-072024-11-072015https://hdl.handle.net/20.500.11801/3747The 2001 bioterrorism attacks to the USA using envelopes containing 𝘉. 𝘢𝘯𝘵𝘩𝘳𝘢𝘤𝘪𝘴 spores increased the concern of scientists to fully understand the mode of action of the anthrax disease. 𝘉. 𝘢𝘯𝘵𝘩𝘳𝘢𝘤𝘪𝘴 produces an exotoxin composed of three proteins. The first protein is the protective antigen (PA), which interacts with the human cell receptor TEM8 & CMG2 to allow the entrance of the two other subunits, edema factor (EF) and lethal factor (LF), to the cell by endocytosis. The EF interacts with the ATP molecules, causing an excess of cAMP which results in edema. On the other hand, the LF was found to cleavage most mitogen activated protein kinase (MAPK) kinases (MKKs) and then the NOD-like receptor proteins (NLRPs), resulting in cells apoptosis. If additional substrates suffer a LF-mediated cleavage, resulting in cell apoptosis, then we suggest novel LF-interacting partners to promote this biological process in gastrointestinal (GI) anthrax. T7 Phage Display (T7PD) is an 𝘪𝘯 𝘷𝘪𝘵𝘳𝘰 technique of combinatorial chemistry that allows the quick selection, amplification, and identification of potential ligands of specific biomolecules. The technique consists on the expression of cloned DNA sequences as fusion proteins on the T7 phage surface, allowing the study of protein-protein interactions. In this work, the technique was used to identify a profile of proteins that interact with LF, as additional substrates, in order to understand GI anthrax 𝘪𝘯 𝘷𝘪𝘵𝘳𝘰. Four T7PD screenings, consisting of three biopanning rounds each one, were performed using a human stomach cDNA library in order to identify proteins that binds LF. A lethal factor wild-type (LF-WT) with metalloprotease activity and a mutant type (LF-MT) without protease activity were used as target to identify different sites for interaction. The T7PD LF- interacting partners were tittered; eventually, 192 were isolated for extract their DNA for a PCR reaction using specific primers to the cloning site. The DNA fragment sizes varied from 300- 900bp. After sequencing 124 clones a total of 33 proteins were identified 𝘪𝘯 𝘴𝘪𝘭𝘪𝘤𝘰, being mostly from protein families such as peptidase A1, lipase, and kruppel C2H2-type zinc-finger protein motifs. From these proteins, 18 were selected for a specificity test consisting of allowing the interaction of individual candidates with each type of LF and the blocking agent (5% casein). A total of 10 T7PD candidates were found to bind at least one type of LF tested. The candidate peptides belong to proteins from families such as peptidase A1, cytochrome, and Cation transport ATPase. The PAP46, a candidate from the peptidase A1 family, was found to interact with both types of LF tested with a target minimal concentration for interaction (MCI) of 1μg/mL. These findings could represent the identification of additional substrates for LF, besides the MKKs and NLRPs. In short, these putative novel peptides that bind LF 𝘪𝘯 𝘷𝘪𝘵𝘳𝘰 can be used to better understand anthrax disease at the molecular level, through the characterization of these substrates, and to develop new therapeutic agents.Los ataques de bioterrorismo en el 2001 a los EE.UU. utilizando sobres con esporas de 𝘉. 𝘢𝘯𝘵𝘩𝘳𝘢𝘤𝘪𝘴 aumentaron la preocupación de los científicos en comprender plenamente el modo de acción de la enfermedad del ántrax. 𝘉. 𝘢𝘯𝘵𝘩𝘳𝘢𝘤𝘪𝘴 produce una exotoxina compuesta de tres proteínas. La primera proteína es el antígeno protector (PA), que interactúa con los receptores de la célula humana TEM8 y CMG2 para permitir la entrada de las otras dos subunidades, factor edémico (EF) y factor letal (LF), a la célula por endocitosis. El EF interactúa con las moléculas de ATP, causando un exceso de cAMP resultando en edema. Por otro lado, el LF fue encontrado de llevar a cabo escisión en la mayoría de la proteínas quinasas activadas por mitógenos (MKKs) y luego en las proteínas receptoras-NOD (NLRPs), resultando en apoptosis de las células. Si sustratos adicionales sufren una escisión mediada por LF, resultando en apoptosis celular, entonces sugerimos nuevos socios interactuantes de LF para promover este proceso biológico en ántrax gastrointestinal (GI). T7 𝘗𝘩𝘢𝘨𝘦 𝘋𝘪𝘴𝘱𝘭𝘢𝘺 (T7PD) es una técnica 𝘪𝘯 𝘷𝘪𝘵𝘳𝘰, de la química combinatoria, que permite la rápida selección, amplificación e identificación de ligandos potenciales para una biomolécula específica. La técnica consiste en la expresión de secuencias de ADN clonados como proteínas de fusión en la superficie de los fagos T7, permitiendo el estudio de interacciones proteína-proteína. En este trabajo, la técnica fue utilizada para identificar un perfil de proteínas que interactúan con LF, como sustratos adicionales, con el fin de entender el ántrax GI 𝘪𝘯 𝘷𝘪𝘵𝘳𝘰 Cuatro monitoreos de T7PD, consistiendo cada uno en tres rondas de bioselección, se realizaron utilizando una biblioteca de ADNc de estómago humano con el fin de identificar aquellas proteínas que se unen a LF. Un LF tipo silvestre (LF-WT) con actividad de metaloproteasa y uno tipo mutante (LF-MT) sin actividad de proteasa, fueron utilizados para diferenciar sitios de interacción. Los interactuantes de LF se cuantificaron; eventualmente, 192 fueron aislados para extraer su AND para una reacción de PCR utilizando iniciadores específicos para el sitio de clonación. Los fragmentos de ADN variaron de 300-900pb. Después de la secuenciación de 124 clones se identificaron un total de 33 proteínas 𝘪𝘯 𝘴𝘪𝘭𝘪𝘤𝘰, siendo en su mayoría de las familias de proteínas tales como peptidasa A1, lipasa, y dedos de zinc tipo C2H2 Kruppel. De estas proteínas, 18 fueron seleccionadas para la prueba de especificidad que consistía en permitir la interacción de candidatos individuales con cada tipo de LF y con el agente bloqueador (caseína al 5%). Un total de diez candidatos de T7PD fueron capaces de enlazar al menos un tipo de LF. Estos péptidos pertenecen a proteínas de las familias peptidasa A1, citocromo y ATPasas de transporte de cationes. La PAP46, un candidato de la familia peptidasa A1, fue encontrado como un enlazador de ambos tipos de LF ensayados con una concentración mínima de interacción para el objetivo (LF) de 1μg/mL. Estos hallazgos podrían representar la identificación de nuevos sustratos, además de las MKKs y los NLRPs para LF. En resumen, estos posibles péptidos noveles que enlazan al LF 𝘪𝘯 𝘷𝘪𝘵𝘳𝘰 pueden ser utilizados para entender mejor el ántrax a nivel molecular, a través de la caracterización de estos sustratos, además, para desarrollar nuevos agentes terapéuticos.EnglishThesisAll rights reserved(c) 2015 Albin A. Cardona-Correa