Detección e identificación de patógenos utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) convencional y de alta fidelidad

Abstract

The sensitivity of standard PCR and high fidelity PCR was compared to identify Candidatus Liberibacter asiaticus, causal agent of “citrus greening”, Ralstonia solanacearum, causal agent of “bacterial wilt in tomato” and Pythium dissotocum, causal agent of “root rot” in cilantro and pea. DNA was extracted using a “DNeasy Plant Mini Kit” of Qiagen. DNA amplification of Candidatus Liberibacter asiaticus was performed from 138 symptomatic and asymptomatic leaves of Citrus sinensis, Citrus latifolia, Citrus limon and Myrtus communis. The High Fidelity PCR was more sensitive to detect Ca. L. asiaticus with primers OI1 and OI2 from 138 samples, twelve samples, that were negative, amplified a 1160 bp band of the 16S rDNA with Hi-Fi PCR. Identification of 16S region of DNAr of Ralstonia solanacearum was carry out with primers 759 and 760. Standard PCR amplified bands of 280 bp corresponding to Ralstonia solanacearum in 18 stem sections of nine plants with bacterial wilt symptoms. High Fidelity PCR produced false negatives. Standard PCR was sensitive to identify R. solanacearum directly from tomato tissue. Identification of Pythium dissotocum was performed from pea and cilantro using primers ITS1 and ITS4. High Fidelity PCR was more sensible than standard PCR, amplified a band of 808 bp corresponding to Pythium dissotocum in all samples analized. High Fidelity PCR allowed increased sensitivity in detection of Candidatus Liberibacter asiaticus from citrus tissue and Pythium dissotocum from pea and cilantro tissue.

Se comparó la sensibilidad de la PCR convencional y de alta fidelidad para la identificación del agente causal del "enverdecimiento de los cítricos", Candidatus Liberibacter asiaticus, Ralstonia solanacearum, agente causal de la "marchitez bacteriana del tomate" y Pythium dissotocum, agente causal de la "pudrición de la raíz" en cilantrillo y arveja. El ADN fue extraído mediante el “DNeasy Plant Mini Kit” de Qiagen. La amplificación de ADN de Candidatus Liberibacter asiaticus se realizó a partir de 138 hojas sintomáticas y asintomáticas de Citrus sinensis, Citrus latifolia, Citrus limon y Myrtus communis. La PCR de alta fidelidad fue más sensible para detectar a Ca. L. asiaticus con los iniciadores OI1 y OI2 en doce muestras que fueron negativas con la PCR convencional, amplificado una banda de 1160 pb del 16S rDNA. En la identificación de la región 16S del ADNr de Ralstonia solanacearum se utilizaron los iniciadores 759 y 760. La PCR convencional amplificó bandas de 280 pb correspondientes a Ralstonia solanacearum en 18 secciones de tallo de nueve plantas con síntomas de marchitez bacteriana. La PCR de alta fidelidad produce falsos negativos. La PCR convencional fue más sensible para identificar a R. solanacearum a partir de tejido de tomate. La identificación de Pythium dissotocum se realizó a partir de arveja y el cilantrillo con los iniciadores ITS1 y ITS4. La PCR de Alta Fidelidad fue más sensible que la PCR convencional, amplificando una banda de 808 pb correspondiente a Pythium dissotocum en todas las muestras analizadas. La PCR de alta fidelidad permitió una mayor sensibilidad en la detección de Candidatus Liberibacter asiaticus a partir del tejido de cítricos y Pythium dissotocum a partir de arveja y cilantrillo