Structure-activity studies, role of transferrin, and gene expression profile of the cytotoxic activity of Ti(IV) complexes in colon adenocarcinoma

Abstract

Ligand modification on titanocene dichloride has the potential to produce soluble and stable complexes. As part of our research efforts in the area of titanium-based antitumor agents, we have investigated the cytotoxic activity of [Ti4(maltolato)8(μ- O)4], (Cp-R)2TiCl2 and (Cp-R)CpTiCl2 (R = CO2CH3 and CO2CH2CH3), and three water soluble titanocene-amino acid complexes—[Cp2Ti(aa)2]Cl2 (aa = L-cysteine, L- methionine, and D-penicillamine)—on the human colon adenocarcinoma cell line, HT29. Both the capacity of these complexes to donate Ti(IV) to human apotransferrin and their hydrolytic stability have been investigated to elucidate how changes in either the ancillary ligands or the functionalized cyclopentadienyl ligands affect their water properties, the titanium intake by human apo-transferrin, and their cytotoxicity in HT29 cells. The amino acid complexes transferred Ti(IV) to human apo-transferrin at a slower rate than titanocene dichloride but eventually loaded both the N- and C-lobes. The functionalized titanocenes, (Cp-R)2TiCl2 and (Cp-R)CpTiCl2 (R = CO2CH3 and CO2CH2CH3), undergo transference of Ti(IV) to human apotransferrin at about the same rate as titanocene dichloride. Notably, the titanium- maltolato complex does not transferred Ti(VI) to human apo-transferrin at any time within the first seven days of its interaction, demonstrating the inert character of this species. Stability studies on these complexes showed that titanocene complexes decomposed at physiological pH while the [Ti4(maltolato)8(μ-O)4] complex was stable at this pH without any notable decomposition for a period of ten days. The antitumor activity of these complexes against colon cancer HT-29 cells was determined using an MTT cell viability assay at 72 and 96 hours. The titanocene-amino acid and the (Cp- R)2TiCl2/(Cp-R)CpTiCl2 (R = CO2CH3 ) complexes were not biologically active when human transferrin was absent; they also were non-active when human transferrin was present at dose-equivalent concentrations. (Cp-R)2TiCl2 and (Cp-R)CpTiCl2 (R = CO2 CH2CH3) showed cytotoxic activity in HT29 cells comparable to that which is displayed by titanocene dichloride. The titanium-maltolato complex had higher levels of cytotoxic activity than any other titanocene complex investigated. Transferrin may be important in protecting the titanium center from hydrolysis, but this may be achieved by selecting ligands that could result in hydrolytically stable, yet active, complexes. The attack to nucleic acids such as DNA apparently are the main cause of the antiproliferative activity shown by titanium complexes in cancer cells, both organometallic as well as inorganic. The microarray data supported a direct DNA- damaging action for titanocene dichloride in HT29 cells, and the new titanium- maltolato complex is correlated with deregulation of genes involved in cell cycle arrest, apoptosis and autoimmune responses. This demonstrates that titanium drugs exert a true cytotoxic effect in HT29 colon adenocarcinoma cells, in which DNA damage is crucial.

La sustitución o modificación de ligandos en dicloruro de titanoceno tiene el potencial de producir compuestos más solubles y estables. Como parte de los esfuerzos de investigación en el área de agentes antitumorales basados en el metal titanio, hemos investigado la actividad citotóxica de [Ti4(maltolato)8(μ- O)4], (Cp-R)2TiCl2 y (Cp-R)CpTiCl2 (R = CO2CH3 and CO2CH2CH3), y tres complejos de titanoceno con aminoácidos – [Cp2Ti(aa)2]Cl2 (aa = L-cisteína, L-metionina, y D-penicilamina) – en la línea celular de adenocarcinoma de colon humano, HT29. Tanto la capacidad de estos complejos de donar el Ti(IV) a la proteína transferrina como su estabilidad hidrolítica ha sido estudiada para investigar como los cambios en los ligandos ancilares o la funcionalización de los ligandos ciclopentadienilos afectan la solubilidad y estabilidad en agua, la capacidad de donar el titanio a la proteína transferina y la citotoxicidad en las células HT29. Los complejos de aminoácido transfirieron el Ti(IV) a la proteína transferina más lentamente que el dicloruro de titanoceno pero eventualmente saturaron ambos lóbulos de la proteína. Los titanocenos funcionalizados, (Cp-R)2TiCl2 y (Cp-R)CpTiCl2 (R = CO2CH3 y CO2CH2CH3), transfirieron el Ti(IV) a la proteína a una rapidez similar al dicloruro de titanoceno. Muy notable, el complejo de titanio y maltol no transfirió el centro metálico a la proteína en ningún momento durante siete días de interacción, demostrando la naturaleza inerte de la especie. Estudios de estabilidad en los complejos demostró que los complejos de titanoceno se descomponen en pH fisiológico mientras que el complejo [Ti4(maltolato)8(μ-O)4] fue estable a estos niveles de alcalinidad sin descomposición notable por un periodo de diez días. La actividad antitumoral de los complejos hacia las células de cáncer de colon HT29 fue determinada utilizando el ensayo de viabilidad celular basado en la reducción mitocondrial del tinte MTT en tiempos de 72 y 96 horas. Los complejos de aminoácido así como los complejos (Cp- R)2TiCl2/(Cp-R)CpTiCl2 (R = CO2CH3) no fueron biológicamente activos en ausencia de transferina; tampoco fueron activos en presencia de transferina a concentraciones equivalentes a la dosis del complejo. Los compuestos (Cp-R)2TiCl2 y (Cp-R)CpTiCl2 (R = CO2CH2CH3) mostraron niveles de actividad citotóxica en las células HT29 comparables a los mostrados por el dicloruro de titanoceno. El complejo de maltol mostró niveles superiores de actividad citotóxica que todos los complejos de titanoceno estudiados. La transferina puede ser importante para proteger el centro metálico de hidrólisis, pero esto puede ser logrado seleccionando ligandos que resulten en complejos hidrolíticamente estables pero a su vez biológicamente activos. El ataque a ácidos nucleicos como el ADN es aparentemente la causa de la actividad antiproliferativa que demuestra el complejo de maltol en células cancerosas. El análisis de expresión es cónsono con el daño directo del dicloruro de titanoceno al ADN, y el nuevo complejo de maltol es correlacionado con desregulación de genes envueltos en arresto del ciclo celular, apoptosis y respuestas autoinmunes. Estos datos demuestran que las drogas de titanio ejercen un efecto citotóxico verdadero en las células de adenocarcinoma de colon HT29 en el que el daño al ADN es crucial.