The effects of the nanotopography of titanium surfaces on osteoblast adhesion and differentiation

Abstract

The principal problem in current orthopedic implants is their loosening due to poor osseointegration. Many efforts have been made to modify the surface composition and topography of titanium alloy implants to attain improved osseointegration. A good combination of porous and thick oxide films on titanium alloy substrates have been obtained with the use of the micro arc oxidation (MAO) procedure. This technique incorporates calcium and phosphorus forming calcium phosphate, a chemical commonly applied to metallic implants as a coating material for fast and firm fixation. The first step in determining the biocompatibility of such modified surfaces is to study cell attachment and proliferation on these substrates. Hence, in the work described herein, the adhesion of human osteoblasts to micro arc oxidized Ti-6Al-4V and γ-TiAl surfaces was examined in vitro. hFOB 1.19 cells were seeded on micro arc oxidized γ- TiAl (MAOGTi) and Ti-6Al-4V (MAOTiV) disks, respectively. Cell adhesion on γ-TiAl and Ti- 6Al-4V thermally oxidized at both 500oC and 800oC were also evaluated. The human fetal osteoblast cell line (hFOB 1.19) consists of immortalized cells that can be subcultured for a long period of time (up to eight months). In addition, they have the ability to differentiate into mature osteoblasts. For comparison purposes, cell morphology and differentiation was observed on thermally oxidized Ti-6Al-4V and γTiAl alloys at 500°C (GTi5, TiV5) and at 800°C (GTi8, TiV8). These alloys were incubated with human fetal osteoblast cell line (hFOB 1.19) at different incubation time points (3 days at 33.5°C and 7 days at 39.5°C) and analyzed by Scanning Electron Microscopy (SEM) and the Alkaline Phosphatase Assay (ALP). Glass coverslips, positive control, were also incubated at these time points.Scanning Electron Microscopy (SEM) and an Alkaline Phosphatase Assay were used to evaluate cell adhesion and cell differentiation on the different surfaces. The Alkaline Phosphatase Assay, at 10 days post seeding, showed significant differences in cell differentiation demonstrating that the roughest surface with treatment and time of exposure of 225mA and 4 minutes was more favorable and Ti-6Al-4V and γ-TiAl alloys without treatment were less favorable, with p values < 0.05 between micro arc oxidized and thermally oxidized coated alloys, Ti-6Al-4V and γ-TiAl, respectively. All SEM images showed that cells adhered on all but TiV8 surfaces, 10 days post seeding. In addition, these highly porous, uniform and thick coatings produced on the surface of both alloys were studied and compared using Atomic Force Microscopy (AFM). A significant relationship was found between the coating characteristics and the voltage-current conditions applied during the micro arc oxidation process. This demonstrated that the surface exposed to the (225mA and 4 minutes) most amperage and time of exposure was the roughest. The SEM analysis demonstrated that hFOB 1.19 cells were able to attach and proliferate on both micro arc oxidized and thermally oxidized γ-TiAl surfaces in a similar manner; however, ALP analysis demonstrated that cell differentiation was significantly higher in the γ-TiAl micro arc oxidized alloys in comparison to Ti-6Al-4V alloys.

El principal problema en implantes ortopédicos actuales es su aflojamiento debido a pobre oseointegración. Muchos esfuerzos han sido realizados para modificar la composición y la topografía de las superficies de aleaciones de titanio, usados en implantes para alcanzar una mejor oseointegración. Una combinación buena de superficies porosas y gruesas de óxido en sustratos de aleaciones de titanio ha sido obtenida con el uso de la técnica de oxidación micro arco (MAO). Esta técnica integra calcio y fósforo que forman fosfato cálcico, una sustancia química aplicado comúnmente a implantes metálicos para una fijación rápida y firme. El primer paso en determinar la biocompatibilidad de tales superficies modificadas es estudiar la adhesión y proliferación de los osteoblastos en estos sustratos. Por ende, en el trabajo descrito, la adhesión y diferenciación de los osteoblastos humanos en las aleaciones Ti-6Al-4V y γ-TiAl oxidados por la técnica de micro arco se evaluaron in vitro. Las células hFOB 1.19 fueron sembradas en los discos de las aleaciones de Ti-6Al-4V (MAOTiV) y γ-TiAl oxidados por la técnica de micro arco (MAOGTi), respectivamente. También, la adhesión de estas células fue evaluada en las aleaciones de γ-TiAl y Ti-6Al-4V oxidados térmicamente a 500ºC y 800ºC. La línea fetal humana de osteoblastos (hFOB 1,19) consiste en células inmortalizadas que pueden ser sub- cultivadas por un periodo de tiempo largo (hasta ocho meses). Además, tienen la capacidad de diferenciarse a osteoblastos maduros. Para propósitos de comparación, la morfología y diferenciación de las células fueron observadas en las aleaciones Ti-6Al-4V y γ-TiAl térmicamente oxidados a 500°C (GTi5, TiV5) y 800°C (GTi8, TiV8). Estas aleaciones fueron incubadas con la línea fetal humana de osteoblastos (hFOB 1,19) en puntos diferentes de tiempo de incubación (3 días en 33.5°C y 7 días en 39.5° C) y analizadas mediante la Microscopia Electrónica de Rastreo (SEM) y el Ensayo Colorimétrico de Fosfatasa Alcalina (ALP). Cubreobjetos de vidrio, el control positivo, también fueron incubados en estos puntos de tiempo. La Microscopia Electrónica de Rastreo (SEM) y el Ensayo de Fosfatasa Alcalina fueron utilizados para evaluar adhesión y diferenciación de las células en las diferentes superficies. El Ensayo de Fosfatasa Alcalina, después de 10 días de incubación, demostró diferencias significativas en la superficie más áspera con tratamiento y tiempo de exposición de 225mA y 4 minutos. Este fue más favorable, con valores P <0,05 entre las aleaciones Ti-6Al-4V y γ-TiAl oxidados por la técnica de micro arco y térmicamente oxidado, respectivamente. Todas las imágenes de SEM mostraron que las células se adhirieron en todas las superficies menos en TiV8, luego de 10 días de incubación. Además, estas capas sumamente porosas, uniformes y gruesas producidas en la superficie de ambas aleaciones fueron estudiadas y fueron comparadas utilizando la Microscopia de Fuerza Atómica (AFM). Una relación significativa fue encontrada entre las características de capa y las condiciones de voltaje-corriente aplicadas durante el proceso de oxidación por la técnica de micro arco. Esto demostró que la aleación de Ti-6Al-4V tratada por la técnica de micro arco (225mA y 4 minutos) fue el más áspero. El análisis de SEM demostró que las células hFOB 1.19 pudieron adherirse y proliferarse en ambas superficies tratadas por la técnica de micro arco y térmicamente oxidada en una manera semejante; sin embargo, el análisis de ALP demostró que la diferenciación de las células fue más alta en las aleaciones de γ-TiAl oxidadas con la técnica de micro arco con respecto a las aleaciones de Ti-6Al-4V.