Identification and molecular characterization of Pigeon pea witches’- broom phytoplasma in plants and its potential vectors in Puerto Rico

Abstract

Few studies have determined the presence of phytoplasma from important crops in Puerto Rico. Disease symptoms resembling those caused by phytoplasma were observed in different plant species such as pigeon pea (Cajanus cajan), periwinkle (Catharanthus roseus), tabebuia (Tabebuia heterophylla), Spanish lime (Melicoccus bijugatus), ixora (Ixora coccinea), mango (Mangifera indica), cactus (Opuntia spp.), citrus trees (Citrus spp.), and coffee (Coffea arabica). Sixty-two plant samples from these species were tested using end point PCR with universal and specific primers (i.e., nested PCR) that prime amplification of the 16S rDNA and ribosomal protein genes (rpIV-rpsC). Fifty-one percent of the samples tested corresponding to periwinkle, pigeon pea, citrus, coffee and tabebuia were positive for phytoplasmas with amplicons of 0.8 and 1.2kb, respectively, depending upon the primers used in PCRs. In both cases the DNA sequences showed 99% of identity with pigeon pea witches’-broom phytoplasma (PPWB) and by restriction patterns (RLFP) obtained from these samples belonged to group 16SrIX. Due to the lack of studies of potential insect vectors, common auchenorrhyncha species were sweep-collected from pigeon pea and citrus and tested for phytoplasma. Of nine insect genera collected, Empoasca kraemeri, Melornemis antillarum and Colpoptera maculifrons were positive for PPWB phytoplasma based on results from conventional PCR and DNA sequence analysis. These findings indicate that these insects fed upon the aforementioned plant species, and may act as potential phytoplasma vectors in the field. Finally, specific primers were designed for qPCR assay to amplify a 102-bp region of the 16S rDNA gene from samples with low level infections of phytoplasma. By the SYBR® Green method, the melting temperature (Tm) recorded in positive samples was 82.3oC. These primers amplified and identified DNA of phytoplasma belonging to the groups and subgroups 16SrV-A, 16SrIII- H, 16SrII-D, 16SrV-C, 16SrII-C, 16SrVI-A, 16SrXII-A and 16SrIX-C.

Pocos estudios han determinado la presencia de fitoplasma de cultivos importantes en Puerto Rico. Se observaron síntomas de fitoplasmas típicos en diferentes especies de plantas como el guandul (Cajanus cajan), playera (Catharanthus roseus), roble (Tabebuia heterophylla), quenepa (Melicoccus bijugatus), cruz de Malta (Ixora coccinea), mangó (Mangifera indica), cactus (Opuntia spp.), cítricos (Citrus spp.) y café (Coffea arabica). Sesenta y dos muestras de plantas de estas especies fueron analizadas mediante PCR convencional con cebadores universales y específicos (para PCR anidada) que amplifican los genes de 16S ADNr y rpIV-rpsC. Cincuenta y uno por ciento de las muestras analizadas correspondientes a muestras de playera, gandul, cítricos, café y roble resultaron ser positivas para la presencia de fitoplasmas produciendo amplicones de 0,8 y 1,2kb, respectivamente. En ambos casos, las secuencias de ADN y los patrones de restricción polimórfica (RLFP) obtenidos a partir de estas muestras mostraron un 99% de identidad con el fitoplasma del gandul perteneciente al grupo 16SrIX. Debido a la falta de estudios sobre potenciales insectos vectores de fitoplasmas, fueron colectadas especies comunes de insectos auchenorrhyncha por medio de una red de barrido en plantas de gandul y cítricos; mismos que fueron analizados para la presencia del fitoplasma. De los nueve géneros de insectos recolectados, únicamente Empoasca kraemeri, Melornemis antillarum y Colpoptera maculifrons fueron positivos para la presencia del fitoplama del gandul mediante PCR convencional y el análisis de secuencias de ADN. Estos resultados indican que estos insectos pueden actuar como potenciales vectores del fitoplasma en el campo. Por último, sobre la base de gen 16S rDNA, un par de cebadores específicos fueron diseñados para amplificar una región de 102pb por medio de ensayos de PCR en tiempo real (RT PCR) en muestras con bajos niveles de infección del fitoplasma. Por el método de SYBR® Green, la temperatura de disociación (Tm) registrada en las muestras positivas fue 82.3oC. Estos cebadores amplificaron e identicaron ADN de fitoplasmas pertenecientes a los grupos y subgrupos 16SrV-A, 16SrIII-H, 16SrII-D, 16SrV-C, 16SrII-C, 16SrVI-A, 16SrXII-A and 16SrIX-C.