A survey of the alkalithermophilic prokaryotic diversity from the hot spring waters in Coamo Puerto Rico.

Abstract

Thermal springs are high temperature aquatic environments. The prokaryotic diversity in these environments has been studied world wide. However, there are few studies on the prokaryotic diversity in thermal springs in Puerto Rico. The main objective of this research was to isolate and characterize alkalithermophilic bacteria from the main thermal spring in Coamo Puerto Rico. To determine the culturable diversity of these bacteria, thermal spring water samples were filtered, plated into Thermus medium (TM) and Alkaline Yeast Extract Malt Medium (AYEMM) and incubated at 70ºC. Selected isolates were characterized by standard microbiological techniques, by scanning electron microscopy, and by growing at optimal pH and different temperatures. Molecular analysis using Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) patterns of a Polymerase Chain Reaction (PCR) amplicon containing the 16S rDNA region was also used to classify the isolates. Taxonomic results indicated that the isolates belonged to the Bacteria Domain. All the 185 strains recovered represented the spore forming genus Geobacillus. This genus has been reported from other hot springs and during this study it was recovered recurrently and was the most abundant in all the three sampling sites of the spring. Many of these isolates showed a wide range of growth at various temperatures and pH values. The ability of these isolates to grow at high temperatures might indicate that they represent the extremophilic diversity of the thermal springs. The Bacterial diversity was also analyzed by culture independent methods like 16S rDNA environmental clone libraries and Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism (TRFLP). Clone libraries were very difficult to achieve due to the low diversity present in the community and chemical complexity of the sample. However, after protocol optimization some clones were obtained and in silico analysis was performed. Environmental sequences belonging to the β-Proteobacteria were the most frequent Operational Taxonomic Units (OTUs), but some OTUs were closely related to members of the Bacteroidetes and γ-Proteobacteria. In addition, some cyanobacterial OTUs were obtained from this environment. TRFLP patterns were also used to study structure and diversity of the 16S rDNA microbial community. The profiles obtained with different enzymes were similar among all the springs, suggesting that the community structure was very homogeneous throughout the sampling area. The combination of morphological, physiological and molecular approaches was very useful to describe the bacterial community present at the thermal spring of Coamo Puerto Rico.

Las aguas termales se caracterizan por ser ambientes acuáticos con altas temperaturas. La diversidad procariota en estos lugares ha sido estudiada alrededor del mundo. Sin embargo, existen pocos reportes enfocados en la diversidad bacteriana presente en este tipo de ambiente en Puerto Rico. El objetivo principal de este estudio lo fue el aislar y caracterizar bacterias alcalino-termofílicas presentes en las aguas termales de los Baños de Coamo en Puerto Rico. Para determinar la presencia de bacterias en estas aguas termales, las muestras fueron filtradas y colocadas en Thermus medium y Alkaline Yeast Extract Malt medium e incubadas a 70º C. Los aislados seleccionados se caracterizaron utilizando microscopía de luz, rastreo y algunas pruebas fisiológicas tales como: pruebas bioquímicas, pH óptimo y temperaturas de crecimiento. Un análisis molecular fue realizado utilizando patrones de RFLP de los productos de PCR conteniendo la región 16S del rDNA para poder clasificar los aislados. Los resultados taxonómicos indicaron que todos los aislados pertenecían al Dominio Bacteria. Los 185 aislados recuperados representaban a la bacteria formadora de esporas Geobacillus. Este género ha sido reportado en otros manantiales termales y fue recuperado con una alta frecuencia, siendo el más abundante en las tres áreas de muestreo de estas aguas. Muchos de los aislados demostraron una gran amplitud de crecimiento a distintas temperaturas y pH. La habilidad de estas cepas de crecer a altas temperaturas, podría indicar que representan la diversidad extremófila de las aguas termales. La diversidad bacteriana también fue analizada mediante técnicas independientes de cultivo, como las librerías genómicas utilizando la subunidad ribosomal 16S y TRFLP. Las librerías genómicas fueron difíciles de obtener debido a la baja diversidad de microorganismos presentes en esta comunidad y la complejidad química de la muestra. Sin embargo, luego de la optimización experimental se obtuvieron algunos clones y estos fueron analizados in silico. Las secuencias ambientales pertenecientes a las β-proteobacterias. fueron UOTs más frecuentes, algunos estrechamente relacionados a miembros de los Bacteroidetes y algunas γ-proteobacterias. En adición a estos, otros UOTs relacionados a las cianobacterias fueron recuperados de este ambiente. Patrones de TRFLP fueron utilizados también para estudiar la estructura y diversidad del 16S rDNA de la comunidad de este ambiente. Los patrones obtenidos con las distintas enzimas fueron similares en casi todas las area de muestreo de las aguas termales, indicando que la estructura de la comunidad es muy homogénea a través del área de muestreo. La combinación de técnicas morfológicas, fisiológicas y moleculares fueron de gran utilidad para describir la comunidad bacteriana de las aguas termales de Coamo Puerto Rico.