Diversity of Actinobacteria associated with Nasutitermes costalis termite and their ability to inhibit the growth of entomopathogenic fungi

Abstract

The Actinobacteria are Gram-positive bacteria with high GC content, spore producers, and have the ability to produce antimicrobial agents. They are capable of degrading structural polysaccharides such as cellulose, lignocellulose and chitin. Previous studies have found this group of bacteria associated with different groups of insects including ants, bees, wasps, beetles, and termites. Actinobacteria have two primary roles in these associations: (1) defend the host from pathogenic organisms and (2) decompose organic matter in the gut. However, is known that the genus Streptomyces (Actinobacteria) is naturally selected to perform these symbiotic relationships. In Attine ants and Beewolf wasps, Actinobacteria protect them against pathogenic microbes. At present it is unknown which Actinobacteria could be associated with termites and if they possess the ability of inhibiting the micelial growth of entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae and Beauveria bassiana, which also affect termites. On the other hand, the termite gut has been extensively explored. In termites gut have been identified Actinobacteria of the genus Streptomyces are believed to help degrade organic matter. In this study we characterized the diversity of Actinobacteria associated with Nasutitermes costalis, a common arboreal termite in Puerto Rico, and evaluated their antifungal capacity against Metarhizium anisopliae and Beauveria bassiana. Two castes of termites (workers and soldiers) and nest material were collected in Miradero forest in Mayagüez, Puerto Rico. We used culture-dependent methods (chitin agar, YMEA) for isolation of Actinobacteria from the nest material, the gut, and the termites exoskeleton . Morphological and molecular techniques (sequencing of 16S rDNA gene) were later used for identification. We isolated 1342 Actinobacteria represented by the genera Streptomyces, Amycolatopsis, Lentzea, Saccharothrix, Pseudonocardia, Microbacterium, and Gordonia. Sequence analysis revealed that the most common genus found in this association is Streptomyces from 73% to 97% of frequency among samples and presents great morphological variation. Phylogenetic analysis shows 15 monophyletic clades that separate the Streptomyces sequences isolated from N. constalis with no match to GenBank database. The most frequent and constant strains in the nest material and exoskeleton of termites were closely related to Streptomyces cavourensis (GenBank, HQ610450.1). Strains closely related to Streptomyces cavourensis (HQ610450.1) were not found in nests abandoned by termites. All selected strains were able to inhibit the growth of M. anisopliae and B. bassiana, but 73% of them were effective in inhibiting micelial growth of B. bassiana from 90% to 100%. The strain W1OE185[6] closely related to Streptomyces cavourensis (HQ610450.1) and the second most abundant in worker exoskeletons was the highest ability to inhibit both fungi. The results indicate that the 15 clades of Streptomyces can be unique in termites, but another gene should be used to confirm this hypothesis. Our results support the existence of Streptomyces symbionts in the system of the termite N. costalis and that one of its roles is the production of antifungal agents.

Las Actinobacterias son bacterias Gram-positivas con alto contenido de GC, productores de esporas, con la capacidad de producir agentes antimicrobianos. Estas son capaces de degradar polisacáridos estructurales como la celulosa, la lignocelulosa y la quitina. En estudios previos han encontrado a éste grupo de bacterias en asociación con diferentes grupos de insectos como las hormigas, abejas, avispas, escarabajos y termitas. Las Actinobacterias tienen dos funciones principales en estas asociaciones: (1) defender al huésped de organismos patógenos y/o (2) descomponer materia orgánica en el intestino. Además se conoce que el género Streptomyces (Actinobacterias) es seleccionado naturalmente para llevar a cabo esta relación simbiótica. En las hormigas Attine y en las avispas Beewolf, las Actinobacterias juega un rol importante contra microorganismos patógenos. En la actualidad se desconoce la comunidad de Actinobacterias asociadas con las termitas, y si éstas poseen la capacidad de inhibir hongos entomopatógenos como Metarhizium anisopliae y Beauveria bassiana, que afectan también a las termitas. Por otro lado, se ha estudiado ampliamente el intestino de las termitas. Se conoce que las Actinobacterias del género Streptomyces ayudan a degradar la materia orgánica en el intestino de las termitas. En éste estudio el objetivo es conocer la diversidad de Actinobacterias asociadas a Nasutitermes costalis, el cual es una termita arbórea común en Puerto Rico. Además se evaluó a través de bioensayos la capacidad antimicótica contra Metarhizium anisopliae y Beauveria bassiana. Para esto se tomaron termitas obreras, soldados y material de nido en una región boscosa en Miradero, Mayagüez, Puerto Rico. Se utilizó métodos dependientes de cultivos (medio de quitina, YMEA) para aislar las Actinobacterias asociadas al material del nido, el intestino y el exoesqueleto de las termitas. Luego se utilizó caracterización morfológica y métodos moleculares (secuenciación de gen del 16S rDNA) para la identificación de los aislados. Durante el proceso se aislaron 1342 Actinobacterias representados por los géneros Streptomyces, Amycolatopsis, Lentzea, Saccharothrix, Pseudonocardia, Microbacterium, y Gordonia. Al analizar las secuencias revelamos que el género más común es Streptomyces que fluctúa entre 73% a 97% de frecuencia entre las muestras y presenta una gran variación morfológica. El análisis filogenético revela 15 clados monofiléticos que separan nuestras secuencias con las parecidas a las de GenBank. Las cepas más frecuentes y constantes en el material del nido y exoesqueleto de las termitas fueron las cercanamente relacionadas a la cepa de GenBank identificada como Streptomyces cavourensis (HQ610450.1). Además, las cepas cercanamente relacionadas a Streptomyces cavourensis (HQ610450.1) no fueron encontradas en nidos abandonados por las termitas. También, todas las cepas seleccionadas fueron capaces de inhibir el crecimiento de M. anisopliae y B. bassiana, pero el 73% de éstas fueron eficaces en la inhibición del crecimiento micelial de B. bassiana de 90% a 100%. Pero la cepa W1OE185[6] cercanamente relacionada a Streptomyces cavourensis (HQ610450.1) y la segunda más abundante en exoesqueletos de obreras fue la de mayor habilidad en inhibir ambos hongos. Estos resultados nos indican que los 15 clados de Streptomyces pueden ser únicos en las termitas, pero es necesario utilizar otro gen para confirmarlo. Nuestros resultados apoyan que existen posibles Streptomyces simbiontes en el sistema de termitas de N. costalis y que una de las funciones que pueden estar realizando sería la producción de agentes antimicóticos.