Phenotypic and genetic characterization of Debaryomyces hansenii strains exposed to cobalt and saline stress

Abstract

Debaryomyces (Torulaspora) hansenii, an osmotolerant yeast of mostly marine origin, has become of keen interest for physiological, metabolic, genetic and molecular studies due to its versatility to survive and thrive under conditions that may be unbearable for other microorganisms. Having been isolated from several habitats that exhibit low water activity, high sugar content, limited carbon sources, high salt concentrations, D. hansenii is a model organism with appealing characteristics for studies ranging from environmental stresses, industrial metabolic capabilities, ecological implications and biotechnological applications. However, the analyses of various D. hansenii strains upon exposure to metal (oxidative) and saline (osmotic) stress, and whether a direct correlation with genotype can be postulated, has not yet been addressed. Therefore, the objectives of this study consisted of: (i) determining the potential of D. hansenii as a biosensor of metal contaminated environments using riboflavin (RF) as an indicator and the description of a RF-impaired mutant, (ii) evalulating the phenotypic diversity of over 30 D. hansenii strains was upon exposure to cobalt (oxidative) and saline (osmotic) stress over a range of concentrations by growth pattern and RF production, and (iii) profiling the genotype of the functional and inducible genes FET3 and ENA1, which have been associated with cobalt and salt stress, using restriction fragment length polymorphism (RFLP) and subsequent analysis on the possible effect of base substitutions on the predicted translated products. Growth and RF production were compared between wild-type D. hansenii and a RF production-impaired metal-tolerant ura3 mutant in the presence of sublethal cobalt(II) concentrations. Debaryomyces hansenii J26 (wild type) exhibited an extended lag phase with an increase in RF synthesis. Supplementation of exogenous uracil shortened the lag phase at the highest concentration of cobalt(II) used, suggesting that uracil has a possible role in metal acclimation. The D. hansenii ura3- mutant exhibited a higher level of metal tolerance, no extended lag phase, and no marked increase in RF synthesis. Restoration of uracil phenotype by transformation with URA3 from Saccharyomyces cerevisiae or D. hansenii did not restore wild-type characteristics, suggesting a second mutation that impairs RF oversynthesis. These results demonstrate that growth, metal sensitivity, and RF biosynthesis are linked. Thirty four D. hansenii strains isolated from various sources were submitted to cobalt and saline stress to evaluate phenotypic variation by colony growth on agar nutrient media plates supplemented with different concentrations of cobalt(II) and NaCl, respectively. Visible RF production was also monitored for strains exposed to cobalt(II). The results demonstrated that no direct pattern of phenotypic variation among the strains could be correlated to the source of isolation. Upon cobalt stress, most strains (~65%) were described as either highly tolerant (dense growth at 1.5 mM) or tolerant (slightly reduced growth at 1.5 mM Co(II)). Very few (three) strains were characterized as being sensitive. Four different strains produced substantial extracellular RF. When exposed to salt stress, no strains were considered highly tolerant but were mostly described as tolerant (~67%; dense growth up to 2 M NaCl). Overall, the results demonstrate mounting evidence that individual strains may express distinct phenotypes, which may depend on different genetic and molecular mechanisms involved in surviving under harsh conditions. To profile for genotypic heterogeneity among the 34 D. hansenii strains analyzed for phenotypic variability, the DNA sequences of the multicopper oxidase gene FET3 and the P-type ATPase sodium efflux gene ENA1 were analyzed using RFLP. Amino acid sequence comparisons of the predicted translated products of each gene were also analyzed to identify conserved regions or domains that may have suffered from base substitutions as detected by RFLP. The results obtained from the FET3 RFLP profiling revealed six distinct genotype patterns, excluding the type sequence pattern of D. hansenii CBS 767T. On the other hand, the ENA1 RFLP analysis discriminated two patterns that varied from the pattern exhibited by the type strain. Amino acid sequence comparison of the FET3 predicted translated product of CBS 767T and possible residue changes based on the RFLP analysis revealed that most regions important for ligands were conserved although changes in residues were found close to these areas and in putative transmembrane helices, which may affect its catalytic activity. Results of the comparison of the putative transmembrane helices identified in the ENA1 predicted translated product showed that at least 3 out of 10 helices may be affected by changes in residues and, thus in conformational structure. To summarize, the observations in this dissertation provide substantial evidence to support D. hansenii as a model organism for understanding the complexity involved in physiological and metabolic processes of higher level organisms and requires an integrated approach that involves further genomic, transcriptomic, and proteomic analyses.

Debaryomyces (Torulaspora) hansenii, una levadura osmotolerante de origen mayormente marina, ha sido de gran interés para los estudios fisiológicos, metabólicos, genéticos y moleculares, debido a su versatilidad en sobrevivir y prosperar en las condiciones que pueden ser insoportable para otros microorganismos. Al ser aislado de varios hábitats que presentan baja actividad de agua, contenido alto de azúcar, fuentes limitadas de carbono, altas concentraciones de sal, D. hansenii es un organismo modelo con características atractivas para los estudios desde cambios o estrés ambientales, sus capacidades metabólicas para la industria, implicaciones ecológicas y aplicaciones biotecnológicas. Sin embargo, los análisis de las diversas cepas de D. hansenii tras la exposición al estrés por metal (oxidativo) y la sal (osmótica), y si una correlación directa con el genotipo puede ser postulado, aún no se ha reportado. Por lo tanto, los objetivos del presente estudio consistió en: (i) determinar el potencial de D. hansenii como un biosensor de ambientes contaminados por metales usando riboflavina (RF) como un indicador y la descripción de un mutante deficiente de RF, (ii) evaluar la diversidad fenotípica de más de 30 cepas de D. hansenii al ser expuesto al estrés celular por el cobalto (oxidativo) y la sal (osmótico) a varias concentraciones mediante el patrón de crecimiento y la producción de RF, y (iii) crear un perfil genotipíco de los genes funcionales e inducibles FET3 y ENA1, los cuales han sido asociados al estrés celular causado por el cobalto y el sal, utilizando los polimorfismos en la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP) y subsecuentemente un análisis sobre el posible efecto de sustituciones de bases en la predicción de los productos traducidos en proteína. El crecimiento y la producción de RF se compararon entre una cepa salvaje de D. hansenii y la producción de RF alterada de un mutante ura3- tolerante al metal en presencia de concentraciones subletales de cobalto (II). Debaryomyces hansenii J26 (cepa salvaje) exhibió una fase de retraso en crecimiento prolongado con un aumento en la síntesis de RF. La suplementación de uracilo exógeno acortó la fase de retraso a la mayor concentración de cobalto (II), lo que sugiere que uracilo tiene un posible rol en la aclimatación por metal en la célula. El mutante ura3- de D. hansenii exhibió un mayor nivel de tolerancia a los metales, sin fase de retraaso prolongado, y no aumentó substancialmente la síntesis de RF. Restauración del fenotipo de síntesis de uracilo por transformación con URA3 de Saccharyomyces cerevisiae o D. hansenii no restauró las características de la cepa salvaje, lo que sugiere una segunda mutación que afecta la sobreproducción de RF. Éstos resultados demuestran que el crecimiento, la sensibilidad al metal, y la biosíntesis de RF están vinculados. Treinta cuatro cepas de D. hansenii aisladas de diferentes fuentes fueron sometidos al estrés celular por el cobalto y la sal para evaluar la variación fenotípica por medio del crecimiento de las colonias sobre placas de agar con medios nutritivos suplementados con diferentes concentraciones de cobalto(II) y NaCl, respectivamente. Producción visible de RF se observó también para las cepas expuestos a cobalto(II). Los resultados demostraron que ningún patrón específico de variación fenotípica entre las cepas podría ser correlacionada con la fuente de aislamiento. Con el estrés de cobalto, la mayoría de las cepas (~65%) se describieron como altamente tolerante (un crecimiento denso en 1.5 mM Co(II)) o tolerante (crecimiento reducido ligeramente en 1.5 mM). Muy pocos (tres) de las cepas se caracterizó como sensible. Cuatro cepas diferentes producieron niveles sustanciales de RF extracelular. Al exponerlos al estrés salino, ninguna cepas fue considerada altamente tolerante, pero la mayoría fueron describidos como tolerante (~67%, un crecimiento denso hasta 2 M NaCl). En general, los resultados demuestran un aumento en la evidencia que apoya que las cepas individuales pueden expresar fenotipos distintos, que pueden depender de diferentes mecanismos genéticos y moleculares implicados en la supervivencia de condiciones adversas. Para crear un perfil de la heterogeneidad genotípica entre las 34 cepas de D. hansenii analizadas para variabilidad fenotípica, las secuencias de ADN de los genes que codifican para la oxidasa de multicobre FET3 y la ATPasa tipo-P del eflujo de sodio ENA1 fueron analizados utilizando RFLP. Comparaciones de secuencias de aminoácidos de los productos traducidos en proteína de cada gen también se analizaron para identificar regiones conservadas o dominios que podrían sufrir alguna sustitución de base detectada por RFLP. Los resultados obtenidos del perfil de FET3 reveló seis patrones de genotipos distintos, excluyendo el patrón de secuencia de la cepa tipo D. hansenii CBS767T. Por otro lado, el análisis de ENA1 discriminó dos patrones que variaban del patrón exhibido por la cepa tipo. La comparación de la secuencia de aminoácidos del producto traducido de FET3 de D. hansenii CBS767T y los posibles cambios en los residuos basadas en el análisis de RFLP reveló que la mayoría de las regiones más importantes para los ligandos se conservaron a pesar de cambios encontrados cerca de éstas áreas y en hélices con transmembrana putativos, los cuales pueden afectar su actividad catalítica. Los resultados de la comparación de las hélices transmembrana putativos identificados en el producto traducido mostró que por lo menos 3 de cada 10 hélices podrían afectar su estructura conformacional. En resumen, las observaciones en esta tesis doctoral proporcionan evidencia sustancial para apoyar a D. hansenii como un organismo modelo para entender la complejidad de los procesos fisiológicos y metabólicos de los organismos de nivel superior y requiere un enfoque mas integrado que involucra análisis genómicos, transcriptómicas y proteómicas.